一、实验目的和内容目的：学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。内容：1．用滤膜法检测大肠菌群。2．用多管发酵法检测大肠菌群。二、实验材料和用具复红亚硫酸钠培养基(远藤氏培养基)、乳糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白胨培养液、三倍浓乳糖蛋白胨培养液、伊红美蓝培养基(EMB培养基)。微孔滤膜(孔径0.45µm)、滤器(容量500mL)、抽气设备、镊子、发酵用试管、杜氏小管、培养皿、刻度吸管或移液管、接种环、酒精灯。三、操作步骤(一)水样的采集1．自来水将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再拧开水龙头流水5min，以排除管道内积存的死水，随后用已灭菌的三角瓶接取水样，以供检测。2．池水、河水或湖水将无菌的带玻塞的小口瓶浸入距水面10～15cm深的水层中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中装满后，盖好瓶塞，取出后立即进行检测，或临时存于冰箱，但不能超过24h。(二)滤膜法检测大肠菌群l．用无菌镊子将一无菌滤膜置于滤器的承受器当中，将过滤杯装于滤膜承受器上，旋紧，使接口处能密封，将真空泵与滤器下部的抽气口连接(图26-1)。2．加水样100mL于滤杯中，启动抽真空系统，使水通过滤膜流到下部，水中的菌细胞被截留在滤膜上。水样用量可适当增减使获得菌落适量。3．用无菌镊子小心将截留有细菌的滤膜取出，平移贴于复红亚硫酸钠固体培养基上(注意无菌操作，滤膜与培养基间贴紧，无气泡)，37℃培养16～l8h。挑选深红色或紫红色、带有或不带金属光泽的菌落，或淡红色、中心色较深的菌落进行涂片和革兰氏染色观察。4．经染色证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，再接种在乳糖蛋白胨半固体培养基上，37℃培养6～8h后观察，产气者证实为大肠菌群阳性。培养中应及时观察，时间过长则气泡可能消失。5．结果计算水样中总大肠菌群数/个•L-1=（滤膜生长的菌落数/过滤水样量/mL）×100（滤膜上菌落数以20～60个/片较为适宜）(三)多管发酵法检测大肠菌群1．取5支装有3倍浓乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每管分别加入水样10mL。另取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每管分别加入水样lmL。再取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每管分别加入按1：10稀释的水样lmL（即相当于原水样0.1mL），均贴好标签。此即为15管法，接种待测水样量共计55.5mL。各管摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。若待测水样污染严重，可按上述3种梯度将水样稀释10倍(即分别接种原水样1mL、0.lmL、0.01mL)、甚至100倍(即分别接种原水样0.lmL、0.01mL、0.001mL)，以提高检测的准确度。此时，不必用3倍浓乳糖蛋白胨培养基，全用乳糖蛋白胨培养基。2．取出培养后的发酵管，观察管内发酵液颜色变为黄色者记录为产酸，杜氏小管内有气泡者记录为产气。将产酸产气和只产酸的两类发酵管分别划线接种于伊红美蓝培养基上，在37℃恒温箱中培养18～24h。挑选深紫黑色和紫黑色带有或不带有金属光泽的菌落、或淡紫红色和中心色较深的菌落，将其一部分分别取样进行涂片和革兰氏染色观察。3．经镜检证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则将此菌落的另一部分接种于装有倒置杜氏小管的乳糖蛋白胨培养液的复发酵管中，每管可接种同一发酵管的典型菌落1～3个，37℃培养24h若为产酸产气者表明试管内有大肠菌群菌存在，记录为阳性管。4．根据3个梯度(10mL、1ml、0.1mL)每5支管中出现的阳性管教(即为数量指标)，查附注的“15管发酵法水中大肠菌群5次重复测数统计表”（表26-2）的细菌最可能数，再乘以100即换算成1升水样中的总大肠菌群数。四、注意事项认真配制不同类型培养基。检测中应合理控制所加的水样量。在滤膜法中每片滤膜的菌落数以20～60个为宜。多管发酵法中水样稀释比例要适宜。挑选菌落时认真选择大肠菌群典型菌落。五、演示1．具有大肠菌群的发酵管中产酸与产气特征的观察。2．在复红亚硫酸钠培养基和伊红美蓝培养基上大肠菌群典型菌落的色泽及特征的识别。六、实验报告(一)实验结果记录1．微孔滤膜法过滤水样量（mL）：，37℃培养后特征菌落数：，接种乳糖培养基后的阳性管数：。总大肠菌群数（个/L）：。2．多管发酵法检测结果（1）根据实验数据查表26—2：（2）多管发酵法结果填于下表中：（3）多管发酵法检测结果：查表结果及总大肠菌群数（个/L）（二）试图解说明检测水样中大肠菌群的操作过程。七、问题和思考1．检查饮用水的中大肠菌群有何意义？比较本实验中两种检测方法的优缺点。2．试设计一个监测某自来水厂水质卫生状况的方案。